实验

分离物质

色谱

  1. 薄层层析1
  2. 柱层析2
  3. 液相色谱3

其他

  1. 旋蒸5
  2. 萃取6

  1. 薄层层析

    样品要求：溶液，对254nm或3__nm的光有吸收，或产生荧光。

    实验装置

    结构

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    原理

    同柱层析1

    原理

    样品在附着在固定相上，被流动相洗脱到流动相中又再次附着。如此往复，在固定项附着强的，与流动相溶解差的，被流动相冲出的距离短。

    与薄层层析相似，均基于化合物在不同相之间的亲和力差异。

    通常，薄层层析的固体相位硅脂，并附有荧光剂。当使用紫外灯照射时，硅脂板发出荧光，被样品覆盖处无荧光，即可得知样品位置。紫外光通常取254nm，因为大\pi键在这个波长上多有吸收。

    操作

    1. 预处理

      • 如果样品是固体，用毛细管轻戳固体样品，确保毛细管内有固体。将毛细管在固体粉末上轻戳（过重毛细管断裂），然后吸入少量溶剂

    2. 取样

      将毛细管尖端置于液面下，经毛细作用液体吸入毛细管。

    3. 点板

      在紫外光照射下，将毛细管垂直轻点在板边缘约1~2 cm处，如未观察到荧光被遮挡（溶液过稀），保持中心不变多次点板。

      通常，需要将多个样品对比（例如，将反应过程中的溶液样品与反应物对比，确定反应是否完全），注意保证样品中心在同一直线上，且平行于板边缘。

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    4. 展开

      如果只需要知道样品中吸收254nm物质是否出现，此处可跳过直接观察即可。常用于柱层析1

      配置展开剂，根据样品极性选择合适的展开剂，目的是展开剂与样品极性相近。展开剂常用乙酸乙酯和石油醚的混合溶液。

      初次展开，先尝试极性较小的展开剂，避免样品随展开剂直接扩散到板边缘甚至板外。注意展开剂量较少，避免覆盖样品点，将样品完全溶解。

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    5. 分析

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      以左一左二为例，假定左一为反应物，左二为反应过程中样品。左二除了与左一相同位置出现标记，还有上下两个。可以认为反应为完全，如果已知最远的是催化剂，则生成物为最近的。

      ‍

    ‍ ↩ ↩ ↩

  2. 柱层析

    样品要求：干燥的固体，对254nm吸收

    实验装置

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    结构

    • 固定相：一种与样品有亲和力（吸附性）的物质，且不溶于流动相。通常为固体。

      • 硅胶，极性强，常用于极性样品
      • 氯化铝，非极性。

    • 流动相：一种样品的（最好是产物的）良好溶剂，且固定相不溶解。为了检验方便，通常选择对254nm不吸收的溶剂。又称洗脱剂。

    • 石英砂：覆盖在样品上方，防止洗脱剂将样品冲散

    原理

    样品在附着在固定相上，被流动相洗脱到流动相中又再次附着。如此往复，在固定项附着强的，与流动相溶解差的，被流动相冲出的距离短。

    与薄层层析相似，均基于化合物在不同相之间的亲和力差异。

    操作

    1. 预处理

      若待测样品为溶液，加入样品2~3倍质量的硅脂干燥。一定保证固体为粉末状。

    2. 加固定相（以硅脂为例，使用湿法装柱）

      • 在柱底塞入少量棉花，避免硅胶流出，但勿塞得过紧，以免影响流速。
      • 将硅脂用洗脱剂（二氯甲烷或石油醚）溶解后，边搅拌边加入柱子中，避免分层。
      • 加入到较满后，加压或常压等待溶剂流下，硅脂均匀地堆积在柱子中。
      • 重复上述操作直到硅脂高度约15cm，如大于15cm过柱速度较慢，但精度无影响。

    3. 润洗

      • 加入洗脱剂充分冲洗柱床，移除杂质并使其稳定。

    4. 加样品

      将样品均匀地铺在固定相上方，如不均匀可轻敲柱子。

    5. 加石英砂

      为避免流动相冲击样品使得样品表面不平，加入不溶于流动相的石英砂约2cm厚。

    6. 洗脱

      • 洗脱剂的选择遵循从低极性到高极性，具体极性可通过薄层层析1测试。如加压，建议减小极性。

      • 加入洗脱剂直到柱子近满，等待洗脱剂将样品冲到固定相，开始分离。

      • 每过一段时间取样进行薄层层析1检查样品是否流出、目标物质是否流出。

      • 每隔一段时间更换收集瓶，重点监控目标化合物是否已流出。

      • 薄层层析中会观察到色斑强度从弱到强再变弱。

    7. 后处理

      • 收集含有目标物的洗脱液，使用旋转蒸发仪（旋蒸）除去溶剂，即得目标化合物。

    ‍ ↩ ↩ ↩

  3. 液相色谱

    样品：溶液，紫外光谱有与展开剂相比有显著不同的吸收峰。

    实验装置

    原理

    同柱层析，

    液相色谱内置了可变波长的紫外灯，可以通过检测分离出的物质对特定hv的吸收强度确定是否有物质流出、流出物质的多少。故吸收强度对时间积分正比于物质的量。

    相同物质，相同溶剂和展开剂下，流速一定，冲洗时长一定相同。所以可以通过对已知物质进行液相色谱，与未知溶液对比，可以确定未知溶液某物质占比。

    通常，作 吸光度-时间 曲线用来分析数据，例如

    ‍

    结构

    注射口，液相色谱仪，柱子。

    根据极性不同选择不同的展开剂和柱子。

    操作

    1. 初始化

      启动液相色谱仪，启动紫外灯，通过其他色谱方法确定使用的紫外光波长。

    2. 安装柱子并润洗

      • 挑选合适的柱子和展开剂

      • 安装柱子

      • 打开液体阀门，用较快的流速润洗管道并排除气泡两到三次

      • 关闭液体阀门，用较快的流速润洗柱子

      • 观察hv吸收强度，等到吸收强度稳定在一个常数时，认为管道初步润洗完成。

        如果吸收强度忽然很大，可能是气泡或上次使用了极性较强的展开剂。

      • 改用目标流速（通常0.8 mL/min）润洗柱子，完成润洗判定同上。

      • 设定当前吸光强度为0

    3. 吸取溶液（该操作可与润洗柱子1同时进行）

      • 查看进液口，确定设备接受的溶液体积，下以\mathrm{20\,\mu L}为例。
      • 使用前，将针头在丙醇溶液（展开剂）中润洗3次。
      • 匀速快速地吸取待测溶液，略大于设备接受体积，如\mathrm{25\,\mu L}.
      • 如管内有气泡，将针管向上，弹击针管使气泡在顶部。
      • 将溶液推到约\mathrm{17\,\mu L}, 排除气泡。推出时用吸水纸包裹针头。

    4. 推入溶液

      • 将针管插入进液口
      • 快速将阀门打开到头，快速推入溶液，快速关闭阀门（避免气泡进入）
      • 拔出针管，在丙醇溶液（展开剂）中润洗3次。

    5. 观察结果

    ‍ ↩

    • 改用目标流速（通常0.8 mL/min）润洗柱子，完成润洗判定同上。 ↩

  5. 旋蒸

    目的：从高沸点溶液中分离低沸点物质（或低沸点溶液分离高沸点物质）

    原理

    --

    操作

    1. 预处理：

      如果溶剂和产物沸点差距小，可尝试先进行萃取。例如用二氯甲烷将反应物从溶剂中萃取到有机相，实现了将溶剂更换为低沸点的二氯甲烷。

    2. 开始旋蒸

      • 打开循环水压缩机（冷凝水制冷和水泵装置，可以使用流动水源代替）
      • 将样品倒入烧瓶，不超过1/3，如过多分多次。
      • 将烧瓶连接到防爆管上，握住烧瓶避免烧瓶掉下。
      • 关闭气阀
      • 打开真空泵，待瓶内气压下到0.3~0.4 atm时，松开烧瓶并开启旋蒸仪。

    3. 处理爆沸

      如果旋蒸途中发生爆沸，处理方法

      • 立即打开气阀，使大气进入旋蒸体系。
      • 在爆沸停止后快速关闭气阀，避免压力差过小烧瓶掉下。

      考虑以下方法减少爆沸

      • 降低旋蒸温度
      • 降低转速
      • 加碎瓷片

    4. 结束旋蒸

      • 停止旋转
      • 手握烧瓶，打开气阀放气。
      • 待气压恢复到接近1 atm时取下烧瓶
      • 根据实际情况：关闭真空泵，关闭循环水压缩机。

    ‍ ↩

  6. 萃取

    样品：根据样品在极性溶剂和非极性溶剂中的溶解性不同分离

    实验装置

    原理

    样品中不同物质极性不同，将样品加入极性小的有机溶剂（萃取剂）和水的体系中，进而分离物质。

    萃取剂常选：乙酸乙酯、异丙醇等。

    如果希望将溶剂溶到水层中，产物溶解到有机溶剂中，注意考虑溶剂和萃取剂是否相溶。

    结构

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    操作

    1. 加入样品和萃取剂

      • 将样品加入梨形分液漏斗中
      • 加入萃取剂
      • 加入饱和食盐水（进一步增强水相极性，破坏乳化）

    2. 摇匀

      • 塞紧塞子

      • 取下任意方式摇匀

      • 每隔一会将放液口朝无人处，上扬漏斗，缓慢打开放液口放出气体

        朝无人处：有液体冲出的风险

      • 重复上述操作数次

    3. 静置

      静置直到溶液分层，界限分明。

    4. 放液

    5. 重复萃取

      （以产物在有机相为例）第一次的水层需要再次萃取。

    6. 处理乳化现象

      如果观察到界限较为分明，但水相（或有机相）仍有一些不融的沉淀或液体（如下图），一般是发生了乳化现象。

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      潜在原因

      • 因某些原因产生表面活性物质。
      • 形成乳浊液
      • 形成胶体
      • etc.

      处理方法

      • 延长静止时间
      • 加入饱和食盐水
      • 分出有机相（水相），再次萃取水相（有机相） ↩